文章信息

● 原名：Tracking mitigation and expression patterns of the antibiotic resistome during full-scale livestock wastewater treatment: Comparison between summer and winter conditions

● 译名：大规模畜禽废水处理过程中抗生素耐药性的缓解和表达模式的跟踪：夏季和冬季条件的比较

● 期刊：Water Research

●  IF：12.4

● 通讯作者：鞠峰

● 通讯单位：西湖大学生命科学学院

● 论文DOI：10.1016/j.watres.2025.124515

导读

畜禽废水是抗生素抗性基因（ARGs）的重要储库，对公共健康构成重大风险。本研究采用宏基因组与宏转录组整合分析技术，全面评估规模化畜禽废水处理厂中ARGs的季节性动态及相关风险。研究显示，未经处理的畜禽废水含有高丰度（4.69±1.93拷贝/细胞，GPC）和高多样性（838种亚型）的ARGs，其水平与人类和猪肠道中的ARGs相当甚至更高。这些ARGs主要编码对常见兽用抗生素的耐药性，包括四环素类（7.4%）、大环内酯-林可酰胺-链阳霉素类（10.4%）和氨基糖苷类（13.2%）。值得注意的是，基于相对丰度，39%的畜禽废水ARGs被进一步确定为高风险ARGs（即可移动、病原体携带且具有临床相关性）。此外，这些畜禽源ARGs的去除效果呈现显著季节性差异：夏秋季节生物处理单元（厌氧消化和活性污泥法）使ARGs丰度降低48-55%，而冬季由于某些质粒相关ARGs的显著富集（特别是在厌氧消化过程中），加之后续活性污泥工艺因微生物群落更替缓慢未能有效去除，导致ARGs丰度反而增加40%。转录谱分析表明，66%-93%的ARGs处于活跃表达状态，其中高风险ARGs（如erm(B)和cfr）在冬季表现出异常高的活性。本研究结果揭示冬季畜禽废水经土地处理后抗生素抗性组的扩散风险，指出通过控制处理设施温度或采用膜过滤工艺可能是去除高风险ARGs及其宿主菌的有效策略。本研究为优化畜禽废水处理、遏制抗菌素耐药性传播提供可操作的见解。

实验设计

主要内容

1. 未经处理的畜禽废水存在显著的AMR风险

研究者根据宏基因组短读长数据对抗性组基本特征（包括ARGs的丰度和多样性）进行评估，结果显示，未经处理的畜禽废水ARGs总丰度为4.69（±1.91）GPC（即拷贝/细胞）。这些ARGs广泛分布于25种类型和838种亚型（补充数据4）。四环素类、大环内酯-林可酰胺-链阳霉素类（MLS）和氨基糖苷类是最主要的ARG类型，其丰度分别占总ARGs的38.7%、25.6%和15.7%（补充图S1）。在亚型水平上，tet(W)（14.4%）、erm(B)（7.4%）和tet(L)（6.5%）是最丰富的ARG家族。在所有检测到的ARG亚型中，有260种ARG亚型在未经处理的畜禽废水样本中普遍存在（在当前研究的12个样本中至少出现在10个样本中）。这些普遍存在的ARGs 占所有畜禽废水样本中ARG丰度的90%以上（补充图S2），表明未经处理的畜禽废水样本具有相对稳定的抗性组特征。特别值得注意的是，研究者重点关注Rank I和Rank II类ARGs，它们分别基于其在人类中的富集性、基因可移动性和宿主致病性，代表当前及未来对人类健康的威胁。结果表明，与健康问题相关的高风险ARGs（n = 326）在未经处理的畜禽废水样本中的总丰度为1.83（±0.60）GPC，其多样性占比为5%，总ARG丰度占比为39%。

为深入探究与抗性组风险相关的关键特征（包括ARGs的可移动性和宿主致病性），研究者开展基于宏基因组组装的抗性组分析。通过对1994853个宏基因组组装的开放阅读框（ORFs）进行鉴定，共识别出414个ARG-ORFs，占总ORFs的0.02%（补充数据5）。虽然基于组装的分析方法在检测抗性组中稀有或低丰度ARGs的灵敏度低于基于宏基因组读长的分析方法，但如后续讨论所示，两种分析方法得出的ARG谱特征具有高度一致性。在所有ARG-ORFs中，46个（Rank I级）和22个（Rank II级）被确定为高风险ARGs，这些基因介导对以下抗生素的广泛抗性：大环内酯-林可酰胺-链阳霉素类（21个）、氨基糖苷类（16个）、四环素类（11个）、β-内酰胺类（6个）、氯霉素类（5个）、多重耐药类（3个）、磺胺类（2个）、多粘菌素类（1个）和氟苯尼考类（1个）。在所有68个高风险ARGs中，16%位于组装的染色体MAGs上，30%位于质粒上，54%位于未定义的重叠群上（图1A）。研究者的结果清晰表明，ARGs的定位（染色体 vs. 质粒）取决于其类型。具体而言，四环素类高风险ARGs主要（73%）由厚壁菌门基因组携带。不同的是，99%的磺胺类高风险ARGs和56%的MLS类高风险ARGs存在于质粒上，显示出显著的可移动性。值得注意的是，氨基糖苷类、β-内酰胺类、氯霉素类和氟苯尼考类的高风险ARGs中，分别有68%、91%、71%和100%属于分类学未定义的重叠群。

为深入评估畜禽废水抗性组的重要性，研究者对其与典型环境及动物肠道样本的抗性组谱进行系统比较，包括猪肠道（n = 18）、医院环境拭子（n = 9）、人类肠道（n = 9）、地表水（n = 9）、湖泊沉积物（n = 9）、活性污泥（n = 16）及森林土壤（n = 9）。为确保与既往研究的公平对比，除本研究采集的未处理畜禽废水样本（n = 3）外，研究者还纳入来自公共数据集的9个样本。结果表明，不同生态系统或栖息地的抗性组谱存在显著差异（P < 0.05）。主坐标分析显示，未处理畜禽废水的抗性组谱与定期饲喂抗生素的猪肠道及人类肠道样本具有相似性。这一现象部分源于这些样本微生物组成的相似性，提示畜禽废水中的抗生素抗性可能更易传播至猪和人类，从而通过“一体健康”框架引发需进一步关注的健康风险。未经处理畜禽废水的总ARG丰度（4.69±1.38 GPC）与猪肠道（4.87±0.51）、人类肠道（3.41±1.48 GPC）及医院拭子（6.94±4.51 GPC）无显著差异，但显著高于自然环境栖息地（如地表水、湖泊沉积物和森林土壤）1-2个数量级。值得注意的是，畜禽废水的ARG丰度还比市政污水处理厂活性污泥（1.02±1.78 GPC）高4.5倍，而活性污泥曾是广泛研究的ARG环境储库。除丰度外，未处理畜禽废水与定期饲喂抗生素的猪肠道样本还表现出最高的ARG丰富度，这可能源于持续且强烈的抗生素选择压力。

图1. 未经处理的畜禽废水抗性组分析及其与其他环境或动物抗性组的比较。 A. 高风险抗生素抗性基因（ARGs）在微生物组中预测定位和宿主内的丰度。B. 基于Jaccard距离的主坐标分析（PCoA），对比未经处理的畜禽废水与其他环境（森林土壤、湖泊沉积物、地表水、活性污泥和医院拭子）或动物（人类和猪）肠道样本的抗性组谱。C-E. 未经处理的畜禽废水及与其他报道的环境或动物样本（猪肠道、人类肠道、医院拭子、市政污水处理厂活性污泥、地表水、湖泊沉积物和森林土壤）相比的ARGs总相对丰度（C，基因拷贝/基因组，GPC）、高风险ARGs相对丰度（D）以及ARGs的chao-1丰富度（E）。星号（*）表示通过Mann-Whitney U检验评估的组间丰度中值存在显著差异（P < 0.05），NS表示无显著差异。

2. 未经处理的畜禽废水存在显著的AMR风险

2.1 夏秋两季抗药性动态与AMR风险缓解效率

畜禽废水通常采用物理与生物联合工艺进行处理。在本研究中，处理设施包含五个处理单元：固液分离、厌氧消化、缺氧处理、好氧处理和沉淀池（图2A）。为揭示废水处理过程中抗性组的变化特征，研究者分别在夏季、秋季和冬季解析了每个处理单元出水口的抗性组谱（基于重叠群水平）（图2B-J，补充数据6）。

结果表明，在夏季，整个废水处理流程共消除134种ARGs（占总多样性的32.4%），其中包括18种高风险ARGs。这些被消除的高风险ARGs介导对以下抗生素的抗性：氨基糖苷类（6种）、MLS类（5种）、四环素类（2种）、多重耐药类（2种）、β-内酰胺类（1种）、氯霉素类（1种）和多粘菌素类（1种）。与此同时，ARGs的总相对丰度在整个处理过程中急剧下降55.4%。具体而言，ARGs的总丰度在厌氧消化后首先下降26.2%，随后经过活性污泥处理（包括缺氧池和好氧池）后进一步降低58.0%。ARGs的减少主要贡献自丰度最高的ARG类型，包括MLS类、四环素类和氨基糖苷类，其去除效率分别达到66%、87%和74%。除这些高丰度ARGs外，该处理工艺还实现对β-内酰胺类和氟苯尼考类ARGs的降解率分别达到82%和85%。

尽管ARGs的总丰度和多样性整体下降，研究者仍发现部分ARGs（n=37）在处理后持续存在或丰度增加。例如，高风险磺胺类抗性基因sul1（rank 1级）的丰度从原废水中的0.15 GPC上升至处理后废水的0.32 GPC（补充信息数据5和6）。该sul1基因与法国铜绿假单胞菌临床分离株中发现的整合子携带型sul1完全相同，表明其具有明确的临床相关性。除sul1外，另有6种高风险ARGs在处理后废水中呈现丰度上升趋势，包括四环素类tetA(P)、氯霉素类catB8、MLS linG、mef(B)、mph(F)和erm(Q)。虽然这些ARGs在整个处理过程中始终维持较低丰度（＜0.01 GPC），但它们在处理后畜禽废水中的持续存在，引发对其向环境储库扩散潜力的担忧。

秋季各处理单元的抗性组结构动态与夏季模式相似，经活性污泥处理后，3种最丰富的ARGs类型—MLS、四环素类和氨基糖苷类的去除效率分别达到83%、73%和73%。然而，与夏季不同，秋季在二次沉淀过程中出现了ARGs相对丰度的"反弹"。具体来说，在检测到的19种ARGs类型中，有12种在沉淀后相对丰度增加，其中包括MLS（增至3.3倍）、四环素类（增至2.4倍）和氨基糖苷类（增至1.24倍）。此外，研究者观察到秋季抗性组中质粒关联ARGs的比例显著高于夏季。合成和携带ARGs的质粒会产生适应性代价，在没有选择压力时通常会被丢失。高比例的质粒关联ARGs表明，尽管秋季ARGs丰富度和丰度与夏季呈现相似的下降模式，但该季节经历了选择性压力，增加AMR的风险。进一步地，研究者采用高风险ARGs的丰度以及一个综合考虑ARGs可移动性和宿主致病性的评分作为废水样本整体AMR风险的指标。结果表明，尽管存在小幅波动，夏秋两季的废水处理仍能降低总体AMR风险，其中生物处理单元（厌氧消化和活性污泥）对ARGs的去除贡献最大。

2.2 冬季污水处理可能增加AMR风险

与夏秋季节抗性组多样性和ARG丰度普遍降低的趋势不同，冬季处理过程中ARGs总丰度呈现出40.2%的增长。该增长主要源于厌氧消化过程的处理效果以及活性污泥池中ARG丰度削减效率的下降。

在冬季厌氧消化过程中，ARGs的总相对丰度从5.16 GPC上升至8.83 GPC。这一增长主要源于130种ARGs（介导对12类抗生素的抗性）的贡献，其中氨基糖苷类（增加1.13 GPC）、四环素类（增加1.07 GPC）、MLS（增加0.77 GPC）、磺胺类（增加0.68 GPC）和氯霉素类（增加0.60 GPC）是丰度增长最显著的ARG类型。值得注意的是，质粒相关ARGs（45个基因）贡献总ARG丰度增长值的47.4%。此外，在消化池中富集的ARGs里，98%的磺胺类、97%的多重耐药类以及80%的氯霉素类抗性基因与质粒存在关联。除这些质粒ARGs外，富集的染色体ARGs（30个）主要由厚壁菌门MAGs（19个）携带，这类菌群常见于厌氧消化系统（补充数据集4和5）。与ARG丰度显著增长相反的是，冬季厌氧消化过程降低ARGs丰富度，从原畜禽废水中消除68种ARGs（占ARG多样性的16.8%），其中包括8种高风险ARGs（介导对β-内酰胺类（3种）、多重耐药类（2种）、多粘菌素类（2种）和MLS类（1种）的抗性）。

与夏秋季节厌氧消化池中ARGs的削减趋势相反，冬季活性污泥处理单元对ARGs的去除效率显著低于夏秋两季。此前研究表明，ARGs的去除主要归因于MLS、四环素类和氨基糖苷类ARGs的减少。为探究冬季去除效率低下的原因，研究者进一步解析上游厌氧消化池和活性污泥缺氧池中这些ARGs的宿主分布。结果发现，宿主微生物周转缓慢是导致ARGs去除效率低下的主要原因之一。例如，unclassified_Saccharofermentanales MAG73携带的tet(M)和cfr(C)基因，在夏秋季节其宿主相对丰度下降超过90%，导致相应编码的tet(M)和cfr(C)基因大幅减少；然而在冬季，该MAG在缺氧池中保持其相对丰度，这可能是由于低温下细菌代谢速率减缓所致，最终导致tet(M)和cfr(C)的去除效率低下。类似现象也在由unclassified_Christensenellales MAG17编码的erm(A)基因中被观察到。另一项解释是质粒相关ARGs在废水处理过程中的增殖行为，实际数据显示，活性污泥处理过程中，质粒相关ARGs在夏季减少23%，秋季减少6%，但在冬季却增加3%（图2E-G）

图2. 夏季、秋季和冬季畜禽废水处理过程中抗性组的变化。RW：原废水；SS：固液分离；AD：厌氧消化池；OT：好氧池；TW：处理后废水。A.所研究养殖场的废水处理单元。B-D. 夏、秋、冬季各处理单元后各类抗生素抗性基因（ARGs）的相对丰度（GPC，即基因拷贝/细胞）。E-G. ARGs的丰富度以及染色体相关、质粒相关和未分类ARGs的相对丰度。H-J.高风险ARGs的相对丰度及由Metacompare计算的整体风险评分。

3. 大多数ARGs在畜禽废水处理过程中处于活跃状态

为评估生物处理单元中ARGs的原位功能活性，研究者从所有调查季节的厌氧消化池、缺氧池和好氧池中采集宏转录组样本。根据转录活性，ARGs被分为三类（补充数据集7）：活跃（转录活性 > 0，表示可检测到表达）、沉默（未检测到表达，但其所在的重叠群或宏基因组组装基因组（MAG）上至少有一个其他基因的转录活性 > 0）和失活（未检测到表达，且同一重叠群/MAG上的所有基因均无活性）。结果表明，所有样本中66%–93%的ARGs（基于丰度）具有转录活性（补充图S3）。其中，冬季好氧池样本的活性ARGs占比最高（93.4%），其次是冬季厌氧消化池样本（84.3%）。这些活跃的ARGs主要介导对氨基糖苷类（37%）、MLS（20%）和四环素类（14%）抗生素的抗性（补充数据集8）。

为了进一步量化和比较活性ARGs的表达水平，研究者引入了相对活性指数(RAI)来基准测试ArGs相对于组装的元基因组中所有家务基因的活性水平(见图3A)。在所有的生物反应器样品中，ARGs的RAI在0.00018到46之间变化很大。通过密度图(图3B)直观地显示ARG RAI的分布，该图显示大多数ARG(>；90%的丰度)的RAI小于1，这表明大多数ARG的活性总体上低于管家基因的平均值，不包括最高10%的值（0-90%范围），以将群落中的异常值影响降至最低。值得注意的是，冬季通常比夏季和秋季表现出更高的转录活性ARG丰度(图3B)。具体而言，冬季好氧池样本中高活性ARGs（RAI > 1）的丰度（0.45 GPC）显著高于夏季（0.03 GPC）和秋季（0.02 GPC）。这些高风险ARGs的异常高活性警示，废水处理过程中可能存在促进AMR风险传播的选择压力。具体而言，研究者在至少一个样本中鉴定出43种RAI大于1的ARGs（补充数据集9）。值得一提的是，冬季好氧池样本中共检测到22种高活性ARGs（其他样本仅检测到5-7种），这证实冬季好氧池中ARGs活性显著更高。在所有异常高活性的ARGs中，有8种被归类为高风险ARGs（表1），可介导对氨基糖苷类（2种）、氯霉素类（1种）、MLS类（4种）和多粘菌素类（1种）抗生素的抗性。夏季好氧池中未发现任何高风险ARGs呈现异常高活性，而冬季则鉴定出四种，包括AAC(6′)-Ib9、aad(6)、erm(42)和cfr(A)。这一发现与冬季ARGs整体富集的现象相一致，表明冬季畜禽废水处理过程中的AMR风险需要进一步加强监测与管控。

图3. 污水生物处理单元中ARGs转录活性水平。A.夏季、秋季和冬季厌氧消化池(AD)、缺氧池(AT)和好氧池(OT)所有活性ARG的相对活性指数(RAI)。夏季、秋季和冬季厌氧消化池(AD)、缺氧池(AT)和好氧池(OT)样品中RAI值的分布。

表1. 至少一个样本中显示RAI>；1的高风险参数的相对活动指数(RAI)值。RAI量化了相对于组装的元基因组中所有管家基因的ARG活性水平。

4. 结合废水污染控制缓解AMR风险

本研究的研究表明，畜禽废水存在显著的AMR风险，但执行良好的处理工艺可有效降低这些风险，尤其在夏季条件下效果更为显著。研究者发现废水理化性质与ARG丰度之间存在相关性，表明某些重要的ARG类型与总有机碳（TOC）、总氮（TN）等指标呈正相关，这提示在处理过程中去除这些污染物可能同时有助于ARG的削减（图4，补充数据10）。具体而言，在26种ARG类型中，有14种与废水TOC呈正相关（p < 0.05，补充数据11），这些ARG在原水样本中占据总丰度的82%（±4%）。类似地，有12种ARG类型与废水TN相关，占原水样本ARG总丰度的86%（±4%）。另一方面，由于该处理设施对磷的去除能力有限，废水总磷浓度（TP）与ARGs未显示出显著相关性。研究还揭示不同ARG类型在去除效率上的关键差异：尤其值得注意的是，MLS、氨基糖苷类和四环素类ARGs在碳源和含氮污染物去除过程中表现出显著的协同削减效应。与此不同的是，磺胺类、杆菌肽类和多重耐药类ARGs的丰度保持稳定甚至丰富度有所增加，凸显了采用深度处理工艺（如臭氧氧化和紫外线消毒）以去除这些顽固性ARGs的必要性。此外，研究发现芽孢杆菌肽（Bacitracin）和利福霉素（Rifamycin）ARGs与废水总氮（TN）呈负相关，这表明参与废水脱氮过程的微生物可能是Bacitracin和Rifamycin ARGs的潜在宿主，这一点可通过宏基因组组装和宿主追踪技术进行验证。尽管Rifamycin抗性基因的丰度极低（<0.09 GPC，补充数据集4），难以成功组装并识别其宿主，但Bacitracin抗性基因（bacA）仍可解析。研究者成功组装29个携带bacA的重叠群（补充数据12），其中17个被追溯至14个MAGs，分属于3个门：变形菌门（Proteobacteria，10个）、拟杆菌门（Bacteroidota，2个）和脱硫杆菌门_I（Desulfobacterota_I，2个）。在这14个MAGs中，有8个隶属于已确认的反硝化菌属：假单胞菌属（Pseudomonas，4个）、索氏菌属（Thauera，2个）、丛毛单胞菌属（Comamonas，1个）和嗜冷菌属（Psychrobacter，1个）。由已知反硝化菌携带的bacA基因占该微生物群落中所有已组装bacA基因总量的48.8%。特别值得注意的是，在冬季好氧池中，这一比例升至90.1%，充分表明脱氮细菌是Bacitracin抗性的主要储存库，并为观测到的Bacitracin ARGs丰度与废水TN之间的负相关性提供机制性解释。

图4. ARGs相对丰度与畜禽废水参数的相关性分析。A.主要ARG类型（大环内酯-林可酰胺-链阳霉素类、氨基糖苷类、四环素类和磺胺类）与总磷（TP）、总氮（TN）及总有机碳（TOC）浓度的散点图。B. 所有ARG类型与废水参数间的斯皮尔曼等级相关系数。星号表示统计显著性：*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。分析的废水参数包括化学需氧量（COD）、氨浓度（NH₃）、电导率（EC）、硝酸盐浓度（NO₃⁻-N）、总悬浮固体（TSS）、挥发性悬浮固体（VSS）、pH、亚硝酸盐浓度（NO₂⁻）及亚硝酸盐/硝酸盐总浓度（NOₓ）。

讨论

未经处理的畜禽废水是抗菌素耐药性（AMR）的一个关键储库，其含有大量与可移动遗传元件和病原性宿主相关的高风险抗性基因。季节性动态显著影响处理效果，温暖季节ARG显著减少与冬季风险形成鲜明对比——后者因厌氧消化过程中质粒相关ARG的传播以及活性污泥中微生物周转的减少而加剧。基于读长和组装的宏基因组分析揭示了抗性组的基本和关键特征，为理解废水处理过程中AMR的传播和削减潜力提供了依据。这些发现强调抗性组动态与季节性运行条件之间的相互作用，为应对畜禽废水管理中的AMR风险提供了理论基础。

1. 宏基因组学解析的畜禽废水抗性组基本与关键特征

宏基因组测序的读长直接分析和组装分析策略，能够系统性地对环境微生物组的结构与功能进行定性和定量研究。利用人工精心整理的数据库SARG v3.0，研究者分析了畜禽废水样本中抗性组的基本与关键特征。通过对比由ARG-OAP工具直接预测为ARG-like的序列与那些比对到ARG-like开放阅读框（ORFs）上的序列，研究者发现几乎所有（96.7%）比对到ARG-ORFs（基于组装）上的读长都被短读长预测方法所捕获，这部分序列占所有预测的ARG-like序列的73.4%。这表明在读长和重叠群水平上，抗性组的分析结果具有高度的一致性。

从多样性角度来看，短读长预测捕获最高的ARG多样性，其中包括新生霉素、防御素、梭链孢酸、嘌呤霉素、四环素霉素C和抗菌脂肪酸等类别的ARGs，这些基因未能通过组装方法有效形成重叠群。这些ARGs在畜禽废水样本中的丰度较低（3.3×10^-3至2×10^-5GPC），这限制基于组装的方法对其的检测（补充数据集4）。在同时通过读长和重叠群水平预测的ARG样序列中，近所有序列（99.9%）被归类为相同的ARG类型，且平均有92.0%的读长被进一步分配至相同亚型（补充数据集13）。相比之下，最常被错误分配的亚型对包括：MLS抗性基因Inu(B)与Isa(E)、氨基糖苷类抗性基因aadA3与aadA、以及四环素类抗性基因tet(X3)与tet(X2)。尽管大多数ARG预测在类型和亚型分类上保持一致，但仅有不到50%（<50%）的短读长被归类为相同的参考基因。考虑到大多数ARG风险评估框架基于宏基因组组装的重叠群和基因进行评估，本研究的结果表明，在基于读长的ARG预测评估AMR风险时应特别谨慎。

基于MAG的分析方法在ARG宿主追踪方面展现出巨大潜力。本研究结果通过将基因追溯至覆盖38个不同属的MAGs，成功识别ARGs的宿主，其中包括8种机会性病原体（补充数据14、数据15和图S4）。研究揭示了几种ARG-宿主模式，例如Proteobacteria作为多重耐药外排泵基因的主要宿主，而Bacillota则主要携带MLS抗性基因（补充文本3和图S5）。尽管这些模式具有潜在科学意义，但研究者强调，仅有不足30%的检测到的ARGs能被明确追溯至宿主MAGs，这限制了本研究得出明确结论的能力。鼓励未来研究采用长读长纳米孔测序或系统发育富集方法，以解决当前ARG宿主追踪的局限性。

总而言之，本研究结果表明，基于读长和基于组装的抗性组分析在类型和亚型分类水平上具有高度一致性。然而，短读长预测在检测稀有ARGs方面灵敏度更高；而基于组装的方法则置信度更佳，能揭示更多遗传关联信息，包括移动遗传元件的携带情况和宿主致病性等。基于本研究，研究者建议采用宏基因组读长分析方法来解析抗性组的基本特征（如丰度和多样性），同时利用基于组装的方法（如在重叠群和宏基因组组装基因组水平）来揭示其他关键抗性组特征（如宿主身份、移动性和致病性），以用于更全面的风险评估。

2. 相对活性指数(RAI)反映ARGs的活性水平

遗传物质的存在会施加代谢负担；因此，在没有抗生素压力的情况下，非必需基因（如ARGs）很可能在微生物增殖过程中失活并丢失。ARGs的转录活性表明携带ARGs的细菌种群的重要性，以及ARGs在生物废水处理单元中被富集的可能性。研究者先前的研究提出，利用单个MAG内的相对表达比率（RER）（即通过比较特定基因与单拷贝标记基因的表达水平）来评估特定基因在其基因组背景下的表达水平。该方法已成功用于监测微生物对环境变化的响应。尽管RER灵敏且准确，但其计算需要重新组装宿主基因组；因此，它不适用于测量MAGs之外的ARGs，而这类ARGs在本研究中占检测到ARGs的60%以上。与先前提出的RER指标相比，研究者新提出的RAI反映的是给定基因相对于宏基因组中所有单拷贝标记基因平均活性水平的相对活性。此外，RAI同时考虑抗生素抗性功能在其宿主内的相对表达活性，以及宿主基因组在微生物群落中的相对表达活性。RAI与RER保持一致，但也能反映未分箱的ARG重叠群的活性水平。与RER类似，高RAI值表明ARGs在样本中被积极表达，这暗示存在潜在的环境选择压力，这些压力可能富集了携带ARGs的细菌或促进了ARGs的传播。

研究结果表明，ARGs主要呈现较低的相对活性水平（RAI = 10^-2–10^-3）。相比之下，已知的废水处理功能基因（如参与氨氧化的amoA和产甲烷作用的mcrA）通常表现出接近或高于1的RAI值（补充数据集16）。ARGs的低RAI值表明，大多数ARGs在宏基因组水平丰度较高，但在转录水平被下调。这一现象说明抗生素抗性功能在废水处理过程中并未被主动激活。然而，ARGs在废水处理微生物组中的持续存在表明，在特定条件（如低温和高抗生素残留）下，这些基因可能具有选择性优势。

ARGs的转录活性可进一步用于区分环境中的ARGs与那些未被成功分箱的微生物重叠群所携带的ARGs。可以推测，具有转录活性的重叠群应源自未能成功分箱的微生物基因组或质粒；而无转录活性的重叠群则更可能是来自死细胞的环境DNA（eDNA）。在畜禽废水样本中，约31%的未分箱重叠群在所有条件下均未显示转录活性，表明它们可能是细胞外DNA（处于失活状态），其丰度占ARG总丰度的0.3%−3%（补充图S3）。然而，这些失活ARGs的丰度低于活性ARGs，因为它们无法随细菌宿主增殖（补充图S6）。因此，本研究在畜禽废水样本中表征的主要抗性组在废水处理系统中是活跃存在且具有功能活性的。

3. 畜禽废水阻隔器的环境健康及工程意义

畜禽废水是"同一健康"框架中的关键联结点，它紧密关联着动物、人类和环境的健康。由于畜禽废水常通过土地施用方式处理，这为环境污染物和潜在的人类暴露风险建立了直接途径，因此其中AMR的缓解尤为重要。畜牧业中传统的废水处理设施历来主要关注减少有机碳和含氮污染物，对作为新兴污染物的ARGs的关注则相当有限。然而，了解ARGs在废水处理过程中的行为特征，对于制定有效的监测和缓解策略至关重要。

本研究结果表明，在温暖季节，典型的厌氧消化和活性污泥废水处理工艺可通过自然微生物周转消除抗生素耐药菌（ARB），从而降低AMR风险。然而，显著问题依然存在：某些ARGs，例如高风险基因sul1，在整个处理过程中未能被有效削减，且处理能力在寒冷的冬季尤其有限。与夏季相对较强的ARG削减能力相比，冬季由于ARGs（特别是在厌氧消化过程中）富集，表现出较高的AMR风险。类似现象也在不同温度下屠宰场废水的厌氧处理中被报道。本研究的多组学分析通过三个关键指标证明AMR风险升高：（1）ARG丰度和多样性增加；（2）质粒介导的可移动ARGs比例上升；（3）抗性基因的转录活性增强，这一现象可能源于多种因素的协同作用，主要是低温抑制了微生物生物量的周转，以及冬季畜牧业中改变废水量和成分的特定操作实践（补充数据1）。此外，为在冬季次优条件下维持出水达标而对废水处理操作条件进行的修改，如延长污泥龄（SRT）和使用化学品，可能进一步促进了耐药性的扩散。尽管本研究的抗性组特征描述和相关分析为这种季节性动态建立了稳健框架，但精确的机制驱动因素仍需通过控制实验来分离温度效应与操作变量，以便未来验证。尽管机制尚未完全阐明，但本研究的发现表明，与夏季相比，冬季将处理后的畜禽废水直接土地应用，具有富集高风险ARGs和ARB的严重风险。因此，需要采取工程控制措施来减轻冬季特有的关键环境健康风险。

本研究结果提出了用以在畜禽废水处理中实现最佳的AMR缓解效果的两个关键工程启示。首先，由于大多数ARGs的归宿本质上与污染物（即总有机碳TOC和总氮TN）的降解过程相关联，因此维持高效运行的厌氧消化（AD）和活性污泥工艺对于污染物去除和AMR缓解至关重要，尤其在冬季。对室外处理设施搭建温室、采用温度控制反应器，或向反应器中投加耐冷微生物进行生物强化等工程控制措施，有助于在低温条件下维持废水处理性能。除此之外，高级深度处理对于解决传统工艺未能有效去除的持久性ARGs（如磺胺类、杆菌肽类和多重耐药类ARGs）十分必要。具体而言，实施膜过滤（如微滤MF、超滤UF、反渗透RO）或末端消毒（如紫外线消毒、氯化消毒）以捕获或灭活ARGs宿主（或抗生素耐药菌ARB），对于缓解处理后畜禽废水排放这些新兴污染物所带来的环境风险变得至关重要。

本研究采用宏基因组与宏转录组方法，表明畜禽废水是高风险、可移动且具有转录活性的ARGs的重要储库。对每个处理单元后的畜禽废水样本进行抗性组特征分析表明，标准的厌氧消化和活性污泥工艺在夏季能够降低AMR风险，这一点经处理后废水样本中ARGs和ARB丰度的降低所证实。然而，这些处理在冬季效果显著下降，表现为冬季处理后的畜禽废水中ARGs丰度较高且其总体相对活性水平升高。研究者对AMR在夏季有效缓解而在冬季失效的演示，揭示了当前畜禽废水处理基础设施的一个关键薄弱环节。通过识别导致这种低效的关键机制（质粒介导的传播增强和微生物周转减慢），本研究的工作为工程干预提供了实际目标。具体而言，开发季节性自适应处理策略，例如优化消化池运行或增强低温下活性污泥的微生物活性，现已成为防止污水处理厂无意中成为AMR放大器的紧迫优先事项，尤其是在高风险冬季。本研究结果揭示不同季节条件下畜禽废水抗性组控制的机制见解，并为未来制定季节性自适应的AMR缓解策略提供了可操作的信息。

资讯来源：微信公众号“微生态”推文《Water Research|西湖大学：整合宏基因组与宏转录组分析全面评估规模化畜禽废水处理厂中ARGs的季节性动态及相关风险》

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