● 第一作者：王美仑

● 通讯作者：陈则友

● 通讯单位：南开大学环境科学与工程学院

图片摘要

简介

近日，南开大学环境科学与工程学院陈则友教授团队在合成生物学领域知名期刊《ACS Synthetic Biology》上发表了题为“Construction and application of a multicolor bactosensor for detecting bioavailable antibiotic mixtures in the environment”的论文。该研究通过在单质粒平台中整合两条基于转录因子的传感通道，并引入抗性基因优化检测效果，构建了一种可以同时检测四环素类与大环内酯类抗生素的多色荧光细菌传感器。研究进一步通过基于智能手机成像的RGB值定量拟合模型减轻对仪器的依赖，并探究了细菌传感器的环境应用能力。该研究展示了双通道细菌传感器在原位检测中的应用潜力，并提供了一种抗生素复合污染中生物可利用浓度的识别策略。

引言

近日，抗生素污染正在成为日益严重的全球性环境问题，环境中的抗生素污染会导致细菌耐药性的发展和传播、微生物群落和元素循环的破坏、鱼类藻类等水生生物生长发育的抑制，并可能通过食物链积累，扰乱人体肠道菌群，导致许多与免疫和代谢有关的疾病。抗生素污染造成的危害不容忽视，因此开发有效可靠的方法检测环境样品中的抗生素，对于评估抗生素残留造成的环境影响以及制定相关标准至关重要。HPLC、GC、LC-MS等仪器方法对于抗生素检测和分析无疑是强大的。然而，高昂的设备成本、复杂的操作技术，繁琐的样品前处理，以及对实验室和技术人员的需要，限制了它们的广泛应用。相比于分析化学方法，生物传感器不需要复杂的前处理，具有成本低、易操作、用户友好等优势，适用于污染物的原位检测。其中，多通道的全细胞生物传感器还可以进一步同时检测多种污染物，为复合污染研究提供参考。基于此，本研究通过将两个基于转录因子的传感通道集于单一质粒，引入耐药基因tetM及mphA优化检测性能，开发了一种新型多色细菌传感器，实现了两类抗生素——四环素类及大环内酯类的同时检测。并从智能手机拍摄的荧光图像中提取RGB值，建立定量拟合模型，从而减轻对酶标仪等仪器的依赖。这一综合设计展现出在环境样本原位检测中的应用潜力。

图文导读

图1. 用于同时检测四环素和红霉素的多色细菌传感器的构建

为了实现稳健、正交、高灵敏的多重抗生素检测，将基于转录因子TetR和MphR的两个传感模块集成到单个细菌中，分别驱动绿色与红色荧光输出。每个传感模块包括一个由中等强度启动子pProA驱动的转录因子和一个强核糖体结合位点(RBS)、由相应的诱导启动子和g10RBS调节的荧光蛋白以及一个强终止子rrnB。通过这种设计，细菌能够同时感知四环素类与大环内酯类抗生素，并将输入信号转化为可区分的荧光信号。对单质粒系统与双质粒系统的比较显示，二者的检测性能基本相当，但质粒骨架更换后引入了较高的背景表达。综合信号可读性与遗传稳定性，最终选择单质粒作为基础架构。在此基础上引入抗性基因tetM和mphA对系统进行优化，其中mphA可通过红霉素磷酸化增强识别灵敏度，tetM 可通过核糖体保护提高对高浓度四环素的耐受性。该优化显著降低了红色通道的检测阈值并拓展其动态范围，同时对绿色通道产生一定影响，可能与细胞代谢负担有关。最终选择了优化的单质粒细菌传感器，即tGmR (tetracycline-GFP and macrolide-RFP) 细菌传感器，进行进一步研究。

图2. tGmR细菌传感器在单抗生素检测中的剂量-效应特性

对tGmR细菌传感器两个信号通道在单一抗生素存在条件下的响应行为进行了系统表征。结果表明，各通道对其对应靶标具有良好的剂量依赖响应关系，并在一定浓度范围内表现出较好的动态范围与灵敏性。tGmR细菌传感器对四环素的检测限为11.1 μg/L、线性范围为10-400 μg/L，对红霉素的LOD为16.3 μg/L、线性范围为60-300 μg/L。此外，tGmR细菌传感器还能检测其他四环素类和大环内酯类化合物，其LOD为多西环素5.4 μg/L，土霉素13.2 μg/L，罗红霉素105.3 μg/L，阿奇霉素4.6 μg/L。总体而言，tGmR细菌传感器在四环素和红霉素的单独检测中具有良好的定量效果。

图3. tGmR细菌传感器在双重抗生素暴露下的剂量-效应及建模

当两种抗生素同时存在时，由于对有限的胞内资源的竞争，两条通道之间会发生一定的信号干扰。当红霉素添加浓度为0-125 μg/L时，0-250 μg/L四环素诱导的整体荧光强度无显著差异(p＞0.05)，而线性拟合仍然稳定，这允许通过分步定量检测四环素和红霉素混合物。此外，分析了使用智能手机在双抗生素暴露和黑暗环境紫外光照射下捕获的细菌传感器图像，并创建了基于RGB值的二次多项式拟合模型。该模型具有较高的拟合精度和稳定的预测性能，可用于预测可能的抗生素浓度组合，提供了通过计算将图像转换为定量信号的概念证明，为细菌传感器的现场应用提供了一种经济高效的策略。

图4. tGmR细菌传感器对不同抗生素的底物特异性

为验证tGmR细菌传感器的底物特异性，将其暴露于九种常用抗生素，以及三种四环素类（四环素、土霉素和多西环素）和三种大环内酯类（红霉素、罗红霉素和阿奇霉素）。在绿色通道中，细菌传感器对四环素类抗生素表现出强烈的反应，对其他抗生素没有反应。在红色通道中，细菌传感器对红霉素和阿奇霉素表现出高特异性，而罗红霉素在相同测试浓度下诱导力较弱。进一步结合剂量–效应曲线与蛋白–配体相互作用分析发现，即使在同一结构类别内，细菌传感器对不同抗生素的检测灵敏度和动态范围仍存在差异，这主要受配体–转录因子亲和力及膜通透性的共同影响。实验结果显示，传感器在复合污染条件下的响应反映的是四环素类和大环内酯类抗生素的整体诱导效应，信号可能由强诱导剂主导，因此可以进行类别层面的筛选，而难以区分并定量同类中的特定化合物。

图5. tGmR细菌传感器在不同pH值、阳离子强度和溶解有机物（DOM）下的检测性能

在复杂环境条件下，传感器响应会受到pH、二价阳离子强度和溶解性有机质等因素的影响，表现为信号减弱或两通道间响应差异。这一现象主要与抗生素在不同环境条件下的形态转化、络合或水解过程有关，从而改变其生物可利用性。相关结果表明，tGmR细菌传感器在一定程度上能够反映环境中抗生素的“有效暴露”状态，可以为环境因素对抗生素物种形成、生物利用度和选择压力的相关研究提供参考，但同时也使其定量对基质条件较为敏感，仍需进一步优化标准化检测体系。最后，通过实际水样中的加标回收实验评估了传感器定量检测的准确性，对四环素的回收率为85.4%～108.2%，红霉素的回收率为82.5%～105.1%，相对标准偏差均低于10%，尽管较仪器方法存在略高的变异性，tGmR细菌传感器仍表现出良好的定量性能。

小结

本研究成功构建了一种单质粒双通道细菌传感器，能够同时区分和定量四环素、红霉素及其混合物，在加标环境水样中展现出良好的检测性能，为四环素及红霉素的点源快速筛查提供了一种有潜力的新工具。后续研究将聚焦于提升灵敏度、降低信号串扰并提高环境适用性，推动其向现场检测迈进。

通讯作者简介

陈则友：南开大学百名青年学科带头人，环境科学与工程学院教授、博士生导师。主要从事抗生素、病原微生物和抗性基因的污染监测、环境行为和风险研究。以第一或通讯作者发表论文30余篇，发表于ISME J.、Natl. Sci. Rev.、Global Change Biol.、Environ. Sci. Technol.、Water Res.、ACS Synth. Biol.、Environ. Microbiol.、Appl. Environ.Microbiol.、Anal. Chem.、科学通报等领域权威期刊；申请发明专利4项。

资讯来源：微信公众号“环境人Environmentor”推文《南开大学陈则友团队ACS Synth. Biol.、Anal. Chem.：合成生物学用于环境抗生素污染检测系列成果》

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