2025年8月7日，乐山师范学院新能源材料与化学学院&乐山市环境监测与污染防控工程技术研究中心石凯副教授、常佳丽教授和江滔教授领衔的研究团队，在国际权威期刊《Sensors and Actuators: B. Chemical》（中科院1区TOP，IF=7.7）发表题为“A novel label-free electrochemical aptasensor for sensitive and selective detection of microplastics based on split gRNA with CRISPR/Cas12a-mediated cascade strand displacement”的创新成果，该研究旨在解决微塑料（MPs）污染监测的难题。微塑料作为一种新兴环境污染物，尺寸小于5μm，广泛存在于水体、土壤及食品中，对人体健康（如引发氧化应激和免疫紊乱）和生态系统构成严重威胁。传统检测方法（如傅里叶变换红外光谱和扫描电镜）依赖昂贵仪器和复杂处理，难以满足现场快速检测需求。本研究创新性地结合CRISPR基因编辑技术与适配体识别，开发了一种高灵敏度、低成本的电化学传感器（CRISPR-MP系统），实现了对聚氯乙烯（PVC）和聚苯乙烯（PS）的高效检测。下面将从研究原理、关键实验、性能优势及实际应用等方面对文章进行系统解读。

一、研究原理与创新设计：分裂gRNA驱动的双信号放大机制

CRISPR-MP系统的核心在于将分裂gRNA（分裂引导RNA）与级联链置换反应（CSDR）结合，实现了对微塑料的特异性识别和信号放大。系统工作原理如图1所示：金电极表面固定富含鸟嘌呤（G）的DNA探针（SH-CP），在钾离子存在下与血红素（hemin）结合形成G-四链体/血红素（G4/hemin）复合物，作为无标记电化学信号源。当微塑料（PVC或PS）存在时，其特异性结合适配体（AP-1/AP-2），释放触发探针（TP）。TP作为入侵链，引发级联链置换反应：首先，TP与预杂交的PP/SP复合物结合，通过趾端区域（toehold）置换出PP，暴露第二趾端；随后，分裂gRNA的sRNA作为燃料链结合第二趾端，置换TP并循环生成大量sRNA/SP复合物。这些复合物激活Cas12a/hRNA复合物的DNase活性，进而切割电极表面的SH-CP探针，导致G4/hemin复合物解离，电化学信号（通过差分脉冲伏安法DPV测量）显著降低。信号变化率（ΔI%）与微塑料浓度成正比，实现定量检测。

该设计的双重创新点在于：

1. sRNA驱动的级联信号放大：利用分裂gRNA的sRNA替代传统CRISPR系统中的完整gRNA，直接驱动CSDR反应，避免了冗余探针设计（如PAM序列需求），简化了体系并降低成本。

2. CRISPR与适配体的首次联用：通过筛选的高亲和力适配体（SELEX技术获得）实现对PVC/PS的特异性识别，结合CRISPR/Cas12a的trans-cleavage活性，提升了检测的选择性和灵敏度。

二、实验验证与可行性分析：多技术表征证实系统有效性

研究通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）验证了CRISPR-MP的可行性。图2A的PAGE分析显示，PVC/PS存在时，PP/SP复合物解离，生成sRNA/SP产物（条带消失），证实级联链置换反应成功触发；无目标物时无背景信号，表明体系稳定性高。电化学表征（图2B-C）展示了电极界面修饰过程：SH-CP/MCH修饰后，CV信号显著降低，EIS电荷转移电阻（Rct）增至2184 Ω，反映DNA负电荷阻碍电子传递；Cas12a激活后，SH-CP被切割，CV信号恢复，Rct降至421.3 Ω，证明DNase活性有效作用。PS检测结果与PVC一致（图S2-S3），确保系统普适性。

DPV信号进一步验证了检测可行性（图3A）：无微塑料时，强电流信号（I₀）对应完整G4/hemin复合物；PVC存在时，信号显著下降（I），ΔI%值随浓度增加而升高（图3B）。实验还发现，微塑料老化（85 °C处理3小时）不影响检测性能（图3C），而适配体结合在4 °C时优于25 °C（图3D），为实际应用提供参数依据。PS测试结果类似（图S4-S7），凸显系统鲁棒性。

三、性能优化与检测效能：高灵敏度与低检测限

通过系统优化关键参数，研究团队提升了CRISPR-MP的检测性能。图4显示：SH-CP探针浓度优化为0.5 μmol/L时，ΔI%值最大（图4A）；sRNA驱动的CSDR中，趾端2长度6 nt时信号最佳（图4B）；CSDR反应时间和Cas12a DNase活性时间分别优化至80 min和30 min（图4C-D），确保高效信号放大。在最优条件下，系统对PVC和PS的检测性能通过DPV校准曲线评估（图5）。PVC浓度在100 ng/mL至1 mg/mL范围内，ΔI%与对数浓度呈线性关系（R² = 0.991），检测限（LOD）达37 ng/mL；PS检测限为45 ng/mL（S/N = 3），灵敏度优于传统方法（如比色法LOD 2.5 ng/mL，表1）。

四、选择性、稳定性与实际应用：环境样本验证潜力

CRISPR-MP系统展现出优异的选择性和实用性（图6）。对PVC/PS的检测ΔI%值显著高于干扰物（如聚丙烯PP、聚碳酸酯PC及非塑料材料PDA），证明适配体特异性高（图6A）。金属离子（如Na⁺、K⁺）和有机污染物共存时，信号无显著影响（图6B），凸显体系抗干扰能力。重现性测试（RSD < 2.7%）和长期稳定性（20天后信号衰减<10%，图6D）确保可靠应用。实际样本（自来水和大渡河水）中添加PVC/PS的回收率达97.6–103.7%（RSD ≤ 4.4%，表2），且成功检测一次性纸杯中的微塑料（图S10），证实其在环境监测中的实用性。

五、结论与平台技术贡献

本研究成功开发了CRISPR-MP系统，整合了分裂gRNA介导的级联链置换、CRISPR/Cas12a的DNase活性和适配体识别，实现了微塑料的无标记、高灵敏检测（LOD低至37 ng/mL）。其创新点包括：sRNA驱动CSDR简化了探针设计，CRISPR与适配体的结合拓展了基因编辑技术在环境分析中的应用。该系统成本低、操作简便，适用于水体、食品等复杂样本的现场快速检测，为乐山市环境监测与污染防控工程技术研究中心的前沿技术研究提供了重要工具，有望推动微塑料污染防控策略的发展。未来工作可探索该系统对其他类型微塑料（如聚乙烯）的普适性，并集成便携式设备实现实地应用。

资讯来源：《Sensors and Actuators: B. Chemical》

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